Кормление птиц и с-х животных. Решаем проблемы вместе!

Метод T-RFLP: основы, техническая база и область применения. Использование T-RFLP для изучения структуры кишечного биоценоза сельскохозяйственных животных.

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) – полиморфизм длин терминальных рестриктных фрагментов – это один из наиболее современных  молекулярно-биологических методов для исследования видового состава микробных сообществ, основанный на изучении особенностей структуры ДНК. Техническую базу метода составляют полимеразная цепная реакция (ПЦР), гель-электрофорез и автоматическое секвенирование. Применение T-RFLP-анализа для исследования структуры микробных сообществ позволяет дополнить данные, получаемые при помощи традиционных культуральных методов или заменить эти методы в тех случаях, где их разрешение оказывается недостаточным. В данной статье рассмотрены основы T-RFLP-анализа, область его применения, а также приведены примеры задач, для решения которых он используется.

Область применения

Одна из основных областей применения метода T-RFLP – анализ структуры и динамики развития микробных сообществ [1]. В последние 10 лет этот метод приобрел большую популярность и широко применяется в этой сфере исследований.

В природе микробные сообщества встречаются повсеместно: в почве, в воде, воздухе, внутри других организмов. Иногда они состоят всего лишь из нескольких видов, но чаще отличаются очень большим видовым разнообразием: в состав сообществ могут входить десятки и даже сотни видов микроорганизмов.

Изучение видового состава биоценозов микроорганизмов имеет большое значение как в фундаментальной науке (для ученых-микробиологов, экологов, почвоведов, геологов и др.), так и в практике. Среди практических областей применения этих исследований – медицина и сельское хозяйство. Здоровье человека и сельскохозяйственных животных в большой степени зависит от того, какие бактерии населяют их организм. В ротовой полости, кишечнике, половых органах существуют сложные многовидовые сообщества микроорганизмов, состав и численность которых может меняться в ответ на изменение условий внешней среды. Эти изменения могут оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на состояние организма-хозяина. Поэтому столь необходимы знания о видовом составе и динамике развития таких биоценозов.

Традиционно для изучения структуры микробных сообществ пользовались методами культуры клеток. В последние 10 лет в арсенале ученых появились молекулярно биологические с методы, которые позволяют значительно дополнить, а часто и заменить культуральные. Как правило, молекулярно-биологические методы основаны на анализе структуры ДНК или РНК. Примерами таких методов служат клонирование генов рибосомальной РНК (рРНК) [2], ARISA (Automated ribosomal intergenic spacer analysis) – анализ вставочных фрагментов в рибосомальных генах [3], анализ полиморфизма ДНК. Последний включает в себя целую группу родственных методов, один из которых – анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов (T-RFLP). Визуализация полученных результатов проводится с помощью различных видов гель-электрофореза (капиллярного, с переменной температурой в градиентном геле и др.)

При изучении состава и динамики развития микробных сообществ метод T-RFLP нередко позволяет получать результаты, более высокой точности и разрешения, чем другие методы, основанные на анализе структуры ДНК [4].

Метод T-RFLP применяют для анализа микробных сообществ воды, почвы, а также биоценозов внутри других организмов. Весьма распространено применение T-RFLP для анализа микробных сообществ в различных системах органов (пищеварительная и мочеполовая системы) человека и домашних животных.

Основы метода

T-RFLP относится к методам, в которых используются молекулярно-генетические маркеры (МГМ) ДНК. Этот вид биологических маркеров позволяет тестировать генетический полиморфизмнепосредственно на уровне самих генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма.

Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями – аллелями. Большинство известных полиморфизмов выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК. Таким образом, у различных организмов, последовательность нуклеотидов в ДНК у отдельных генов может отличается. Часто такие отличия являются таксономическим признаком: с помощью молекулярно-генетических маркеров можно в ряде случаев определить организм с точностью до вида [5].

T-RFLP анализ основан на различиях в последовательности гена 16S РНК*, так как у многих видов микроорганизмов полиморфизмы этого гена являются таксономическим признаком.

Последовательность операций при работе методом T-RFLP такова представлена на схеме (рис. 1) [6]. На первом этапе выделяют препарат, содержащий смесь ДНК микробного сообщества. В качестве источника ДНК можно использовать воду, биологические жидкости (кровь, слюна, желудочный сок и др) – выбор делают в зависимости от объекта исследования.

Рис. 1. Общая схема T-RFLP-анализа.

Затем амплифицируют («размножают») ген 16S РНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого подбирают специфические относительно этого гена праймеры*. Используют праймеры с флуоресцентной меткой; при использовании двух праймеров (прямого и обратного) они должны быть промаркированы различными флуоресцентными метками. В реакционную смесь для реакции ПЦР кроме образца ДНК и праймеров добавляют ДНК-полимеразу*, буфер для ДНК-полимеразы,MgCl₂ и смесь нуклеотидов (из них ДНК-полимераза будет синтезировать новые цепи ДНК). Общий объем реакционной смеси может отличаться в разных вариантах метода, но, как правило, он составляет 50 мкл [10]. В реакции ПЦР нагревание реакционной смеси чередуется с охлаждением. При нагревании происходит «плавление» ДНК (расплетание двойной спирали), а при охлаждении идет процесс репликации (синтез новой цепи ферментом ДНК-полимеразой на матрице материнской цепи). Число циклов и температурный режим подбирают в каждом случае индивидуально.

Продукт полимеразной цепной реакции очищают , затем разрезают на фрагменты с использованием специфических ферментов – эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы узнают строго определенную последовательность нуклеотидов в цепи ДНК (от 4 до  – и именно там происходит разрезание цепи [5]. Место, в котором происходит разрезание ДНК специфической эндонуклеазой, называется сайтом рестрикции. Для работы методом T-RFLP, как правило, подбирают рестриктазы с 4-нуклеотидным сайтом рестрикции [6].

После рестрикции проводят разделение полученной смеси фрагментов ДНК методом капиллярного или гель -электрофореза. Полосы на электрофореграмме образуют только терминальные (концевые) фрагменты ДНК, так как они содержат флуоресцентно меченный праймер. Фрагменты разделяются в геле в зависимости от их длины (рис. 2). Чем меньше длина фрагмента , тем дальше он мигрирует в геле относительно линии старта. Чем ближе фрагмент расположен к линии старта, тем больше его длина. Вместе с изучаемыми образцами ДНК в электрофорезе проводят разделение образца, содержащего фрагменты ДНК известной длины – специальные стандарты. Относительно их расположения можно примерно оценить длину фрагментов из опытной пробы. Для того, чтобы отличить стандарты от опытных образцов, в них другой тип флуоресцентной метки. Теоретически, образцу ДНК каждого биологического вида, присутствующего в пробе, будет соответствовать одна из полос (а затем один из пиков на электроферограмме).

Рис. 2. Электрофореграмма. 

На следующем этапе полученные результаты интерпретируют при помощи автоматического лазерного секвенатора и получают электроферограмму, содержащую двумерные пики, отличающиеся по ширине и высоте. Ширина пика (ось Х) отражает длину соответствующего фрагмента ДНК, а высота пика (ось У) – его ширину. Таким образом, каждой полосе электрофореграммы соответствует определенный пик на электроферограмме (рис. 3).

Рис. 3. Электроферограмма.

Электроферограммы анализируют с помощью компьютерных программ, используя также базы данных, содержащие информацию об уже известных последовательностях ДНК.

Интерпретация результатов и возможные трудности при использовании метода T-RFLP

Как правило, для интерпретации результатов, полученных методом T-RFLP, используют компьютерные базы данных, в которых содержится информация о нуклеотидных последовательностях известных видов животных и бактерий. Наряду с базами данных для анализа результатов T-RFLP применяются и специализированные компьютерные программы. Они позволяют рассчитать длину терминальных фрагментов рестрикции, которые могут быть получены при использовании различных эндонуклеаз, а также применять различные статистические методы при работе с данными электроферограммы.

Применение компьютерных баз данных позволяет значительно увеличить эффективность T-RFLP-анализа [7]. В сети Интернет доступ к интерактивным средствам обработки данных T-RFLP возможен через Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu) [8], сайт Microbal Community Analysis (MiCA) университета штата Айдахо (http://hermes.campus.uidaho.edu) или коммерческие компьютерные программы программы (например, GeneMapper [6]), PAT (The T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool) –филогенетический определитель для T-RFLP-анализа [9]. Эти программы позволяют сравнивать данные T-RFLP –анализа с теоретически рассчитанными размерами фрагментов рестрикции гена 16S рРНК. В процессе сравнения проводят поиск участков гомологии между изучаемыми последовательностями и последовательностями сравнения. Результаты могут быть улучшены, если в эксперименте проводить несколько серий рестрикции с использованием нескольких эндонуклеаз, имеющих разные сайты рестрикции в пределах последовательности гена 16S рРНК.

При анализе многовидовых систем метод оптимизируют, устанавливая необходимую степень совпадения наблюдаемых результатов с теоретическими данными. То есть устанавливают, при каком количестве несовпадений между опытной последовательностью ДНК и теоретически рассчитанной последовательностью сравнения их считают идентичными. Степень совпадения/несовпадения последовательностей, то есть уровень «загрубления» результатов подбирают в каждом случае индивидуально. Кроме того, устанавливают линию cut-off, то есть пики, площадь которых меньше определенной величины, считают случайными и в анализ не включают.

Хорошие результаты дает параллельная обработка результатов T-RFLP-анализа как с использованием библиотек клонов и программы PAT (см. выше)[9]. Более 60% видов бактерий определяются обоими методами, что позволяет значительно повысить достоверность и надежность полученных данных.

Вообще, интерпретация данных T-RFLP-анализа – это сложный процесс, требующий комплексного подхода. Кроме того, есть ряд факторов, которые могут влиять на получаемый результат. К таким факторам относится концентрация ДНК в пробе, температурный режим и число циклов ПЦР, выбор ДНК-полимеразы для ПЦР.

Одной из проблем, с которыми можно столкнуться при работе методом T-RFLP, является появление псевдо-терминальных фрагментов рестрикции. На электроферограмме они образуют «ложные» пики, которые могут ввести исследователя в заблуждение. Так, для многих видов бактерий на графике кроме «основного» пика выявляются еще и дополнительные пики. Из-за этого сложно определить, является ли конкретный пик «дополнительным» к какому-то виду или он соответствует другому виду микроорганизмов. Сайт рестрикции для «дополнительных» пиков всегда находится дальше от конца нуклеотидной цепи, чем основной сайт рестрикции. Это позволяет предположить, что такие «дополнительные» пики являются результатом неполного расщепления продуктов ПЦР эндонуклеазами рестрикции [10]. Еще одним источником «ложных» пиков может служить гетерогенность последовательности 16S рРНК: у некоторых видов бактерий и архей в геноме присутствует несколько оперонов* 16S рРНК, нуклеотидная последовательность которых несколько отличаются между собой [11].

Неполная рестрикция может быть вызвана разными причинами и является наиболее частой и наиболее сложно устраняемой причиной формирования псевдо-пиков. Так, для многих рестриктаз субстратом служит только двуцепочная молекула ДНК. «Плавление» ДНК,то есть формирование одноцепочных участков, особенно на 5’-концах, делает ДНК недоступной для таких рестриктаз.

Наличие вторичной структуры в гене 16S рРНК также затрудняет процесс рестрикции, делая сайт рестрикции труднодоступным для ферментов. Наличие вторичной структуры в гене 16S рРНК можно с достаточно большой вероятностью предсказать с помощью программы mfold (M. Zucker; http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna/). Хотя каноническая форма ДНК является термодинамически наиболее стабильной, в условиях очень высоких температур рестрикции (для некоторых рестриктаз требуемая температура более 90 ˚С) каноническая структура теряет стабильность, что может сделать сайты рестрикции недоступными для эндонуклеаз.

При подборе режима ПЦР важно помнить, что в ряде случаев могут создаваться условия, способствующие формированию псевдо-пиков. Например, вероятность их формирования возрастает с увеличением числа циклов ПЦР. Если в реакции используется пара праймеров (прямой и обратный), то они могут расходоваться в реакционной смеси неравномерно. Это приводить к формированию одноцепочных участков ДНК.

Таким образом, есть два основных источника формирования псевдо терминальных фрагментов рестрикции в T-RFLP-анализе: частично одноцепочные ампликоны, которые могут образовываться в ходе ПЦР, и наличие вторичной структуры в гене 16S рРНК, особенно в области сайта рестрикции.

Для того, чтобы снизить вероятность ошибочного истолкования формирующихся пиков, рекомендуется параллельно с анализом изучаемого микробного сообщества проводить анализ видов, входящих в его состав, с помощью векторного клонирования*[10].

Несмотря на возможные неточности, связанные неоднозначностью интерпретации результатов, метод T-RFLP несомненно является одним из наиболее подходящих и достоверных для анализа состава сложных микробных сообществ [12].

Примеры задач, для решения которых можно использовать метод T-RFLP

В связи с тем, что T-RFLP-анализ является перспективным инструментом для изучения кишечной микрофлоры домашних животных, приведем несколько примеров задач, для решения которых может быть использован этот метод.

Здоровье животного, его рост и развитие во многом зависят от состояния кишечной микрофлоры. «Полезные» виды бактерий, населяющие кишечник, способствуют правильному пищеварению, помогают извлекать и усваивать организму-хозяину питательные вещества, содержащиеся в химусе. С другой стороны, «вредные» виды бактерий могут паразитировать в разных отделах кишечника, выделяя бактериальные токсины и угнетая рост «полезных» бактерий, чем наносят организму животного-хозяина большой вред. Для того, чтобы определять, какие именно виды бактерий доминируют в кишечном биоценозе и как он изменяется в различных условиях содержания и питания животных, с успехом применяется метод T-RFLP.

Несколько групп ученых проводили сравнительный анализ видового состава микробных сообществ в подвздошной и слепой кишках у цыплят [13, 14]. Было установлено, что биоценоз подвздошной кишки отличается меньшим разнообразием, по сравнению со слепой кишкой. С помощью метода T-RFLP было выявлено 15 видов бактерий в биоценозе подвздошной кишки. Из них большую часть представляют грам-положительные бактерии с низким суммарным содержанием G-C пар в геноме. По данным исследования, более 70% всех бактерий, входящих в состав биоценоза, относятся к Lactobacillus и Enterococci. Третья важная группа полезных бактерий, идентифицированная c помощью метода T-RFLP – бутират-производящие бактерии. Эта группа бактерий имеет хороший потенциал в качестве пробиотиков для птицеводства. Но для того, чтобы их использовать в этом направлении, потребуется более подробное изучение данной группы микроорганизмов в кишечнике бройлеров и других видов сельскохозяйственных животных [13].

Кишечный биоценоз животных очень чувствителен к применению антибиотиков в кормлении. Так, группой Wise M.G. и Siragusa G.R. [14] было проведено сравнительное исследование кишечных микробных сообществ у цыплят, получавших стандартный рацион (контрольная группа) и рацион, не содержащий антибиотиков-стимуляторов роста. Для анализа использовали метод RT-PCR и T-RFLP. Было установлено, что антибиотики-стимуляторы роста угнетают «полезные» Lactobacillus и Enterococci в подвздошной кишке. Однако в слепой кишке эти препараты могут успешно предотвращать колонизацию потенциально патогенным бактериями рода Campylobacter.Для того, чтобы предохранить животных от развития патогенных штаммов микроорганизмов и при этом исключить из рациона антибиотики, будут проводиться дальнейшие исследования.

Употребление в пищу мяса птицы, зараженного Campylobacter – одна из самых распространенных причин развития энтеритов у людей в развитых странах. Эти бактерии обнаруживаются в 81% куриного мяса и у 30% индюшачьего (до 10⁷ клеток на 1 грамм массы в слепой кишке). Считается, что в кишечном биоценозе птиц Campylobacter является комменсалом. Но организм-комменсал может при определенных условиях становиться паразитом. В исследовании Scupham A.J. [15] с помощью методов ARISA и T-RFLP было показано, что видовой состав кишечного биоценоза динамично меняется в течении 7 недель жизни бройлера. Сначала в составе сообщества преобладают энтерококки, бактерии группы кишечной палочки и клостридии. Затем состав сообщества изменяется: доминируют клостридии, споромуза, энтеробактерии и бактероиды. В процессе развития кишечного биоценоза лактобактерии и протеобактерии имеют тенденцию к снижению численности, тогда как численность бифидобактерий возрастает. Хотя экология Campylobacter в кишечнике изучена на данный момент недостаточно, но с помощью метода T-RFLP уже установлено, что виды этого рода бактерий могут колонизировать слепую кишку на разных стадиях жизненного цикла птиц, независимо от того, какие виды бактерий доминируют в кишечном биоценозе цыпленка на данный момент. С помощью метода T-RFLP в этой работе было также показано, что заселение Campylobacter может происходить вне зависимости от состава «родной» микрофлоры кишечника на данный момент. Кроме того, вероятность заражения Campylobacter выше при содержании птицы в условиях свободного выгула [16].

Использование метода T-RFLP помогает и в изучении влияния пробиотиков на состав и численность кишечной микрофлоры животных и служит достойной альтернативой другим молекулярно-биологическим методикам, применяемым в для этих целей. Метод T-RFLP c успехом применялся для изучения кишечной микрофлоры у крыс и мышей, в диету которых вводили пробиотики Lactobacillus[17]. У мышей, получавших с кормом L. casei и L. plantarum, отмечалось более густое заселение кишечника полезными видами лактобактерий [18]. Сопоставление результатов, полученных с использованием различных методик, проводили при помощи многовариантных статистических методов.

А в 2004 г изучалось действие пробиотиков линии Lactobacillus на состав микрофлоры слепой и тонкой кишки цыплят. Наблюдения за контрольной группой цыплят и опытной (получавшей пробиотики L. agilis и L. aviarius с кормом) велись как в обычных условиях, так и в условиях искусственно созданного теплового стресса. По данным исследования средняя численность бактерий в слепой кишке бройлеров составила примерно 1х10¹¹ бактерий. С помощью компьютерной базы данных были предсказаны длины терминальных рестрикционных фрагментов для различных видов Lactobacillus (c использованием коммерческих эндонуклеаз рестрикции Hha1 или Msp1).

По результатам анализа было построено две электроферограммы: одна – для рестрикции с помощью эндонуклеазы Hha1, другая — для рестрикции Msp1. При сравнении длин полученных в эксперименте фрагментов рестрикции с теоретически рассчитанными были выявлены статистически достоверные совпадения: в кишечном биоценозе определялось до 10 видов Lactobacillus (L. gallinarum, L. agilis, L. aviarius, L. fermentum, L. reuteri, amylovorus, L. crispatus, L. acidophilus, L. salivarius salivarius, L. salivarius salicinus, L. gasseri), а также виды Enterococcus, Clostridium и Ruminococcus [10]. Важно отметить, что именно методом T-RFLP во многих случаях становится возможным определить таксономическую принадлежность организма с точностью до вида.

При сравнении состава кишечной микрофлоры в опытной и контрольной группах цыплят были получены следующие результаты. При обычном режиме кормления (без введения пробиотиков) численность Lactobacillus, необходимых для правильной и эффективной работы пищеварительной системы, снижается по мере взросления цыпленка, и в кишечнике 54-дневных цыплят они уже не обнаруживаются. У опытной группы цыплят,напротив, L. agilis, L. aviarius , а также другие виды молочнокислых бактерий обнаруживаются в тонком кишечнике, причем их количество не падает при взрослении цыпленка. Численность бактерий группы Enterococci в возрасте 54 дней была выше в контрольной группе, чем в опытной. Эти данные, полученные методом T-RFLP, согласуются с результатами, полученными при помощи культуральных методов.

Действие пробиотиков на биоценоз кишечника бройлеров было проводилось также в условиях теплового стресса. После того, как цыплята перенесли тепловой стресс, в кишечной микрофлоре особей из контрольной группы преобладали  L. salivarius и Enterococcus spp, отмечался дефицит многих видов «полезных бактерий». А у опытной группы доминировали L. agilis, L. aviaries и L. acidophilus, стабильность кишечного биоценоза выше, чем в контрольной группе. Таким образом, применение пробиотиков Lactobacillus способствует стабилизации кишечного биоценоза у молодых бройлеров и восстановлению кишечной микрофлоры в условиях стресса. Также важно отметить, что метод T-RFLP позволяет детально определять структуру микробных сообществ с достаточно высокой точностью и является удобным инструментом для изучения влияния пробиотиков на микрофлору кишечника [19].

В заключение отметим, что высокое разрешение, которое обеспечивает T-RFLP-анализ при изучении структуры микробных сообществ, в сочетании с практичностью метода и удобством его использования делают T-RFLP очень перспективным для дальнейших исследований в этой области. В нашей стаье приведены лишь некоторые примеры использования T-RFLP-анализа. Пластичность метода позволяет применять его для решения широкого круга задач, связанных с изучением биоценозов микроорганизмов.

Список использованных сокращений и терминов

16S рРНК – вид рибосомной РНК

Ампликон – продукт амплификации ДНК. В лабораторных условиях – продукт ПЦР.

Векторное клонирование (молекулярное клонирование) – процесс выделения фрагмента ДНК и его направленного копирования (создания множества копий) внутри живой клетки. Обычно этот процесс включает 4 стадии: фрагментация ДНК рестриктазами, лигирование (сшивка) с вектором, трансфекция в клетку и затем отбор полученных клонов.

ДНК-полимераза – фермент, производящий репликацию ДНК на матрице материнской цепи.

Каноническая форма ДНК – форма двойной спирали, где две полимерные нити ДНК закручены друг относительно друга вокруг общей оси и удерживаются вместе за счет парных взаимодействий G с С и А с Т. Биологически активна.

Оперон – функциональная единица генома прокариот, содержащая несколько генов и один общий промотер

Праймер – это короткая цепь нуклеотидов ДНК , которая служит «затравкой» при репликации ДНК. В естественных условиях (в клетке) праймеры предстваляют собой короткие участки РНК. Праймеры необходимы в реакции ПЦР, так как фермент ДНК-полимераза, реплицирующий ДНК, может добавлять нуклеотиды только к уже имеющемуся двуцепочному «началу» цепи. В данном случае праймеры представляют собой химически синтезированные олигонуклеотиды (около 20 оснований).

ПЦР – полимеразная цепная реакция

Рестриктаза – эндонуклеаза рестрикции, фермент, разрезающий ДНК на фрагменты в строго определенном месте.

Список литературы

1.       Schütte U. M. et al. 2008. Advances in the use of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis of 16S rRNA genes to characterize microbial communities. Appl Microbiol Biotechnol.;80(3):365-80.

2.       Xiang Y. Zhu et al. 2002. 16S rRNA-Based Analysis of Microbiota from the Cecum of Broiler Chickens. Appl.Microbiol; Jan. 2002, p.124-137.

3.       Welkie D. G. et al. 2009. ARISA analysis of ruminal bacterial community dynamics in lactating dairy cows during the feeding cycle. Anaerobe. 2009 Jul 15. [Epub ahead of printing].

4.       Kitts C. L. 2008. Terminal restriction fragment patterns: a tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics. Appl Microbiol Biotechnol.; 80(3):365-80.

5.       Свердлов Е.Д. 2007-2008. Курс лекций по молекулярной генетике. Биологический факультет МГУ.

6.       Applied Biosystems. 2005. Terminal Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) Analysis on Applied Biosystems Capillary Electrophoresis Systems.

7.       Nakano Y. et al. 2008. Development and application of a T-RFLP data analysis method using correlation coefficient matrices. Microb Ecol.; 56(2):322-31.

8.       Marsch T. L. et al. 2000. Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism analysis program, a web-based research tool for microbial community analysis. Appl. Environ. Microbiol. 66:3616-3620.

9.       Kent D. Angela et al. 2003. Web-Based Phylogenetic Assignment Tool for Analysis of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiles of Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol.; 69(11): 6768-6776.

10.    Egert M. and Friedrich W. M. 2003. Formation of Pseudo-Terminal Restriction Fragments, a PCR-Related Bias Affecting Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of Microbial Community Structure. Appl. Environ. Microbiol.; 69(5):2555-2562.

11.    Chin K. J. et al. 1999. Structure and Function of the methanogenic archaeal community in stable cellulose-degrading enrichment cultures at two different temperatures (15 and 30 degrees C). FEMS Microbiol. Ecol.; 30:313-326.

12.    Hartman N. and Widmar F. 2008. Reliability for detecting composition and changes of microbial communities by T-RFLP genetic profiling. FEMS Microbiol. Ecol.; 63(2):249-60.

13.    Gong J. et al. 2007. Molecular analysis of bacterial populations in the ileum of broiler chickens and comparison with bacteria in the cecum. J Appl Microbiol.; 102(4):1138-49.

14.    Wise M. G. and Siragusa G. R. 2007. Quantitative analysis of the intestinal bacterial community in one- to three-week-old commercially reared broiler chickens fed conventional or antibiotic-free vegetable-based diets. J Appl Microbiol.;102(4):1138-49.

15.     Alexandra J. Scupham. 2009. Campylobacter colonization of the Turkey Intestine in the context of Microbial Community Development. Appl. Environ. Microbiol.; 75(11):3564-3571.

16.    Esteban J. I. et al. 2009. A survey of food-borne pathogens in free-range poultry farms. J Appl Microbiol.;106(5):1540-8.

17.    Kaplan C. V. et al. 2001. 16S ribosomal DNA terminal restriction fragment pattern analysis of bacterial communities in feces of rats  fed Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl. Environ. Microbiol.; 67:1935-1939.

18.    Fuentes S. et al. 2008. Administration of Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum affects the diversity of murine intestinal lactobacilli, but not the overall bacterial community structure. Res Microbiol.;159(4):237-43.

19.    Pham Thi Ngok Lan et al. 2004. Effects of two probiotic Lactobacillus strains on jejunal and cecal microbiota of broiler chicken under acute heat stress condition as revealed by molecular analysis of 16S rRNA genes. Microbiol. Immunol.; 48(12):917-929.

Материал подготовила Горст К.А., 2010