Кормление птиц и с-х животных. Решаем проблемы вместе!

Методика определения ТБА-числа (тио-барбитуровой кислоты)

Методика, используемая компанией Kemin http://www.kemin.com/

1. Цель исследования

Определение окислительного статуса жиров и жиросодержащих компонентов (жиров и кормов) по результатам анализа малонового диальдегида (МДА).

Принцип: МДА реагирует с тио-барбитуровой кислотой (ТБА) при 100^оС в присутствии трихлоруксусной кислоты, образуя цветной комплекс. Цветной комплекс может анализироваться методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или спектрофотометрически.

2. Реактивы, материалы и оборудование 

2.1. Реактивы и материалы

• Milli-Q вода  или деминерализованная вода
• ТБК (2-тиобарбитуровая кислота) ч.д.а., 0.2%  раствор в воде Milli-Q (0,2 г кислоты на 100 мл воды).
• ТХУ (Трихлоруксусная кислота), ч.д.а., 5 % раствор в Milli-Q воде (5 г кислоты растворить в 100 мл воды).
• TЭП (1,1,3,3-тетраэтоксипропан) ч.д.а.., приготовить маточный раствор, содержащий 30-50 мг ± 0.1 мг в 100 мл Milli-Q воды.
• Ацетонитрил  (АЦН) для жидкостной хроматографии высокого давления
• KH₂PO₄ ч.д.а.
• NaOH : 1Н
• Мерные колбы на 100 мл и 1000 мл
• Водяная баня 100°C + 1°C
• Аналитические весы  + 0,001 г
• Микропипетки  0.1 – 10 мл
• Центрифуга (12000 об./мин)
• Центрифужные пробирки для 12000 об./мин
• Пробирки на 150 мл
• Тест пробирки на 20 мл
• Одноразовые фильтры 0.45 m (для водной фазы)
• Обычное лабораторное оборудование

2.2.Система Высокоэффективной  Жидкостной хроматографии высокого давления:

• Насос: TSP P2000, скорость 0.5 мл/мин, изократическая или эквивалентная.
• Приготовление элюента :
  Раствор  0.01M KH₂PO₄ в Мilli-Q воде: взвесить 1,36 г KH₂PO₄ , поместить в колбу на 1000 мл,  добавить 900 мл воды и растворить.
  Довести до pH=7 с помощью 1Н NaOH, затем  довести объем до метки.
  Добавить 200 мл АЦН к 800 мл буфера или приготовить раствор из 20 % АЦН и 80 % буфера с помощью  насоса TSP 2000.
• Автоматическая пипетка: TSP AS1000 или эквивалентная.
• Параметры определения:  UV-Vis детекция, длина волны 532 нм.
• Колонка : Нуклеозил  100-5, C18, 250 x 4,6 mm + pre-column, каталожный номер no. CP 29370 или эквивалентная.
• Анализ данных с помощью программного обеспечения РС1000 или эквивалентного.

2.3 Спектрофотометрия

Для определения можно использовать обычный Uv-Vis спектрофотометр, если нет оборудования для ВЭЖХ

3. Анализ

• Взять навеску 5г гомогенного образца (взвешивать в пробирке на 150 мл), предварительно удалив крупные частички и катышки.
• Добавить 50 мл 5% раствора ТХУ. Для экстракции твердой фракции жира требуется предварительно нагреть образец на водяной бане до образования гомогенного раствора.
• Провести экстракцию в течение минимум 15 минут при постоянном перемешивании (на магнитной мешалке).
• Центрифугировать до получения чистого (прозрачного) раствора.
• Отобрать 5 мл супернатанта в 20 мл тест-пробирку, добавить 5 мл 0,2% раствора ТБА. Хорошо перемешать.
• Приготовить одно стандартное разведение (или серию стандартных разведений) из маточного раствора ТЭП в 5% ТХУ, от 10 до 100 мкг МДА в 100 мл раствора.
• Внести 5 мл стандартного раствора и 5 мл 0,2% раствора ТБА в тест-пробирку на 20 мл. Хорошо перемешать.
• Поместить тест-пробирки в кипящую водяную баню примерно на 30 мин.
• Достать пробирки из водяной бани и остудить до комнатной температуры.
• Центрифугировать до получения чистого (прозрачного) раствора. При необходимости отфильтровать на 0.45 m одноразовом фильтре.
• Поместить 20 мкл стандартного раствора (раствора сравнения) и 20 мкл опытного (исследуемого) раствора в ВЭЖХ-систему. Сравнить удержание и площадь пиков при элюции у стандартных образцов и исследуемых. Исходя из полученных данных, рассчитать концентрацию МДА в образце.
• В качестве альтернативного способа детекции можно измерить для исследуемого раствора и раствора сравнения поглощение при длине волны 532 нм (раствор сравнения: 5 мл раствора ТХУ + 5 мл воды).
• Сравните площади пиков стандартных образцов и опытных (или поглощение опытного раствора и раствора сравнения). Рассчитайте концентрацию МДА в исследуемом образце с помощью компьютерной программы (МДА, г/в образце).